Interferentzia-faktoreak PCR erreakzioetan

PCR erreakzioan zehar, interferentzia-faktore batzuk aurkitu ohi dira.
PCRren sentsibilitate oso altua dela eta, kutsadura PCRren emaitzetan eragiten duen faktore garrantzitsuenetako bat da eta emaitza positibo faltsuak sor ditzake.
Berdin kritikoak dira emaitza faltsu-negatiboetara eramaten duten iturri desberdinak. PCR nahasketaren funtsezko zati bat edo gehiago edo anplifikazio-erreakzioa bera inhibitzen edo oztopatzen bada, diagnostikoa oztopatu daiteke. Horrek eraginkortasuna murriztea eta emaitza negatibo faltsuak ere ekar ditzake.
Inhibizioaz gain, xede-azido nukleikoaren osotasuna galtzea gerta daiteke laginak prestatu baino lehen bidalketa- eta/edo biltegiratze-baldintzen ondorioz. Bereziki, tenperatura altuak edo biltegiratze desegokiak zelulak eta azido nukleikoak kaltetu ditzakete. Zelulen eta ehunen finkapena eta parafina barneratzea DNAren zatiketaren kausa ezagunak dira eta arazo iraunkor bat (ikus 1. eta 2. irudiak). Kasu horietan, isolamendu eta arazketa optimoek ere ez dute lagunduko.

1. irudia | Immobilizazioak DNAren osotasunean duen eragina
Agarosa gelaren elektroforesiak erakutsi zuen autopsien parafina ataletatik isolatutako DNAren kalitatea nabarmen aldatu zela. Batez besteko zatien luzera ezberdineko DNA atera zen finkapen metodoaren arabera. DNA jatorrizko izoztutako laginetan eta tamponatutako formalina neutroan finkatuta bakarrik kontserbatu zen. Bouin finkatzaile biziki azidoa edo azido formikoa duen formalina tamponatu gabekoa erabiltzeak DNAren galera handia eragin zuen. Gainerako frakzioa oso zatitua dago.
Ezkerrean, zatien luzera kilobase bikoteetan (kbp) adierazten da

2. irudia | Azido nukleikoen helburuen osotasuna galtzea
(a) Bi kateetan 3′-5′ hutsuneak helburuko DNAren haustura eragingo du. fragmentu txikian DNAren sintesia gertatuko da oraindik. Dena den, DNA zatian inbaditzeko gune bat falta bada, anplifikazio lineala baino ez da gertatzen. Kasurik mesedegarrienean, zatiak elkarren artean birsaturatu daitezke, baina etekinak txikiak eta detekzio-mailen azpikoak izango dira.
(b) Baseen galerak, batez ere depurinazioaren eta timidina-dimeroaren sorreraren ondorioz, H-loturen kopurua gutxitzea eta Tm-aren murrizketa dakar. Berotze-fasean luzanga-fasean, lehengaiak matrizeko DNAtik urrunduko dira eta ez dira errekostuko baldintza hain zorrotzetan ere.
(c) Aldameneko timina baseek TT dimero bat osatzen dute.
Diagnostiko molekularrean sarritan gertatzen den beste arazo bat helburu azido nukleikoen askapen optimoa baino txikiagoa da fenol-kloroformo erauzketarekin alderatuta. Muturreko kasuetan, hori negatibo faltsuekin lotu daiteke. Denbora asko aurreztu daiteke irakinaren lisiaren edo zelula-hondakinen digestio entzimatikoaren bidez, baina metodo honek askotan PCR sentsibilitate txikia eragiten du, azido nukleikoen askapen nahikoa ez delako.

Anplifikazioan polimerasaren jardueraren inhibizioa

Orokorrean, inhibizioa edukiontzi kontzeptu gisa erabiltzen da PCR emaitza ez-optimoak lortzen dituzten faktore guztiak deskribatzeko. Zentzu hertsiki biokimikoan, inhibizioa entzimaren jarduerara mugatzen da, hau da, substratu-produktuen bihurketa murrizten edo saihesten du DNA polimerasaren gune aktiboarekin edo bere kofaktorearekin (adibidez, Mg2+ Taq DNA polimerasarako) elkarreraginaren bidez.
Laginaren osagaiek edo erreaktiboak dituzten hainbat buffer eta extractek entzima zuzenean inhibi dezakete edo haren kofaktoreak (adibidez, EDTA) harrapatzen dituzte, horrela polimerasa desaktibatuz eta PCR emaitza negatibo faltsuak edo gutxitzea eraginez.
Hala ere, erreakzio-osagaien eta xedea duten azido nukleikoen arteko elkarrekintza asko "PCR inhibitzaile" gisa ere izendatzen dira. Isolamenduaren ondorioz zelularen osotasuna hautsi eta azido nukleikoa askatzen denean, laginaren eta inguruko disoluzioaren eta fase solidoaren arteko elkarrekintzak gerta daitezke. Esate baterako, 'eskubideek' kate bakarreko edo bikoitzeko DNA lotu dezakete interakzio ez-kobalenteen bidez eta isolamendua eta arazketa oztopatu dezakete azkenean PCR erreakzio-ontzira iristen diren helburuen kopurua murriztuz.
Oro har, PCR inhibitzaileak diagnostiko proba klinikoetarako erabiltzen diren gorputz-fluido eta erreaktibo gehienetan (urea gernuan, hemoglobina eta heparina odolean), dieta-osagarrietan (osagai organikoak, glukogenoa, gantz, Ca2+ ioiak) eta inguruneko osagaietan (fenolak) daude. , metal astunak)

PCR inhibitzaile nagusiagoak bakterioetan eta zelula eukariotoetan, xede ez den DNAn, ehun-matrizeetako DNA lotzen dituzten makromolekulak eta laborategiko ekipamenduetan, hala nola eskularruak eta plastikoak, aurki daitezke. Erauzketan zehar edo ondoren azido nukleikoak garbitzea da PCR inhibitzaileak kentzeko metodo hobetsia.
Gaur egun, erauzketa automatikoko hainbat ekipamendu eskuzko protokolo asko ordezka ditzakete, baina helburuen %100eko berreskurapena edo/eta arazketa ez da inoiz lortu. Inhibitzaile potentzialak azido nukleiko purifikatuetan egon daitezke oraindik edo dagoeneko eragina izan dezakete. Inhibitzaileen eragina murrizteko estrategia desberdinak daude. Polimerasa egokia aukeratzeak eragin handia izan dezake inhibitzaileen jardueran. PCR inhibizioa murrizteko frogatutako beste metodo batzuk polimerasa kontzentrazioa handitzea edo BSA bezalako gehigarriak aplikatzea dira.
PCR erreakzioen inhibizioa barne prozesuen kalitate-kontrola (IPC) erabiliz froga daiteke.
Kontuz ibili behar da erauzketa-kitaren erreaktibo guztiak eta bestelako disoluzio guztiak, hala nola, etanola, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanola eta fenola, azido nukleiko isolatutik garbiketa sakon baten bidez. Haien kontzentrazioen arabera, PCR aktibatu edo inhibitu dezakete.