Interferentzia faktoreak PCR erreakzioetan

PCR erreakzioan zehar, oztopatzen diren faktore batzuk maiz izaten dira.
PCRren sentsibilitate oso handia dela eta, kutsadura PCRren emaitzetan eragina duten faktore garrantzitsuenetakoa da eta emaitza positibo faltsuak sor ditzake.
Berdin kritikoak dira emaitza faltsuak ekarriko dituzten hainbat iturri. PCR nahasketaren zati edo anplifikazio erreakzioaren zati ezinbestekoak edo gehiago oztopatzen edo oztopatzen badira, azterketa diagnostikoa oztopatu daiteke. Horrek eraginkortasun murriztua eta emaitza negatibo faltsuak sor ditzake.
Inhibizioaz gain, xede azido nukleikoaren osotasuna galtzea gerta daiteke bidalketa eta / edo biltegiratze baldintzak direla eta prestaketa prestatu aurretik. Bereziki tenperatura altuak edo biltegiratze eskasa, zelulak eta azido nukleikoak kalteak sor ditzakete. Zelula eta ehunen finkapena eta parafina txertatzea oso ezagunak dira DNAko zatiketaren eta arazo iraunkorraren arrazoiak (ikus 1. eta 2. irudiak). Kasu horietan, isolamendu eta arazketa optimoak ere ez du lagunduko.

1. irudia | Immobilizazioaren eragina ADN osotasunean
Agarose Gel Electroforesis-ek erakutsi zuen autopsien parafina ataletatik isolatutako DNA kalitatea asko aldatu zela. Batez besteko zatien luzera desberdinen ADNa extracts-en egon zen finkapen metodoaren arabera. DNA izoztutako laginak eta formalin neutroan finkatutakoan bakarrik kontserbatu zen DNA. Azido finko edo desblokeatu gabeko azido formakoak erabiltzea, Formin-ek, DNA galera handia izan zuen. Gainerako zatikia oso zatikatua da.
Ezkerrean, zatien luzera kilobase bikoteetan adierazten da (KBP)

2. irudia | Azido nukleikoen helburuak osotasuna galtzea
(a) Bi kateetan 3'-5 'hutsuneak xede ADNan atsedenaldia ekarriko du. DNAren sintesia zati txikian gertatuko da oraindik. Hala ere, primer estazio gunea DNA zatian falta bada, anplifikazio lineala soilik gertatzen da. Kasurik onuragarrienean, zatiek elkarrengandik berrerabil dezakete, baina etekinak detekzio maila txikiak eta azpitik egongo dira.
(b) Oinarriak galtzea, batez ere, desinazioaren eta thymidine dimer formazioaren ondorioz, H-Bonuen kopurua eta TM-ren beherakada bat da. Berotze-fase luzatuan, primarioak Matrix DNAtik urtu egingo dira eta ez dute baldintza zorrotzagoetan ere okertuko.
(c) ondoan dagoen timina oinarrien oinarriak TT dimer bat osatzen dute.
Diagnostiko molekularretan maiz gertatzen den beste arazo arrunta da xede azido nukleikoen askapenik ezin hobea, fenol-kloroformaren erauzketarekin alderatuta. Muturreko kasuetan, hau ezezko faltsuekin lotuta egon daiteke. Denbora asko gorde daiteke lises edo gelaxka-hondakinen digestio enzimatikoan irakiten, baina metodo honek PCR sentsibilitate txikia sortzen du azido nukleiko nahikoa askatzeko.

Anplifikazioan polimerasaren jarduera inhibitzea

Oro har, inhibizioa edukiontzi kontzeptu gisa erabiltzen da PCR suboptimalen emaitzak eragiten dituzten faktore guztiak deskribatzeko. Zentzu zorrotz biokimikoan, inhibizioa entzimaren jarduerara mugatzen da, hau da, substratu-produktuen bihurketa murrizten edo prebenitzen du ADN polimerasaren edo haren kofaktikoaren gune aktiboarekin (adibidez, MG2 + Taq DNA polimerasarentzat).
Laginetako edo erreaktiboek dituzten osagaiek edo erreaktiboak dituzten osagaiek zuzenean enzimoa inhibitu dezakete edo bere cofaktoreak harrapatu (adibidez, EDTA), horrela polimerasa pictictivating eta PCRren emaitza negatibo edo faltsuak izan daitezkeela.
Hala ere, erreakzioen osagaien eta xede azido nukleikoen arteko interakzio asko ere "PCR inhibitzaileak" izendatzen dira. Zelularen osotasuna isolamendua eten eta azido nukleikoa askatzen da, laginaren eta inguruko soluzioaren eta fase solidoaren arteko interakzioak ere gerta daitezke. Adibidez, 'Scavengers'-ek DNA bakarka edo bikoitza lotu dezake, elkarreragin ez-kobalenteen bidez eta isolamendua eta arazketa oztopatu ditu PCR erreakzio ontzira iristen diren helburu kopurua murriztuz.
Oro har, PCR inhibitzaileak diagnostiko klinikoko proba eta erreaktibo gehienetan presente daude (Urea gernuan, gernuan, hemoglobina eta heparina odolean), dieta osagarriak (osagai organikoak, glukogenoak, gantzak) eta ingurumeneko osagaiak (fenolak, metal astunak)

PCR inhibitzaile nagusienak Bakterioetan eta zelula eukariotikoetan, ez da zuzendutako DNA, ehun matrizeen eta laborategiko ekipamenduetan, esaterako eskularruak eta plastikoak. Azido nukleikoen araztegia erauzketa zehar edo ondoren PCR inhibitzaileak kentzeko metodoa da.
Gaur egun, erauzketa automatikoko ekipamendu automatizatuak eskuzko protokolo ugari ordezkatu ditzake, baina% 100 berreskuratzea eta / edo helburuak ez dira inoiz lortu. Balizko inhibitzaileak oraindik ere presente egon daitezke azido nukleiko araztuetan edo dagoeneko eragin izana. Inhibitzaileen eragina murrizteko estrategia desberdinak daude. Polimerase egokiak aukeratzeak eragin handia izan dezake inhibitzaileen jardueran. PCR inhibizioa murrizteko beste metodo frogatuak polimerasaren kontzentrazioa handitzen ari dira edo BSA bezalako gehigarriak aplikatzen dituzte.
PCR erreakzioak inhibitzea prozesuaren kalitatearen kontrolaren (IPC) erabiltzearen bidez frogatu daiteke.
Arreta hartu behar da erauzketa-kit-en erreaktibo eta irtenbide guztiak kentzeko, esaterako, etanola, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, ISopropanol eta Phenol, azido nukleikotik garbitzeko urrats sakon baten bidez. Kontzentrazioaren arabera, PCR aktibatu edo inhibitu dezakete.