PCR erreakzioetan interferentzia faktoreak

PCR erreakzioan zehar, faktore interferentzial batzuk aurkitzea ohikoa da.
PCR-aren sentikortasun handia dela eta, kutsadura PCRren emaitzetan eragina duten faktore garrantzitsuenetako bat dela uste da eta emaitza faltsu positiboak sor ditzake.
Era berean, funtsezkoak dira emaitza faltsu-negatiboak eragiten dituzten iturri desberdinak. PCR nahastearen edo anplifikazio-erreakzioaren beraren zati esentzial bat edo gehiago inhibitzen edo oztopatzen badira, analisi diagnostikoa oztopatu daiteke. Horrek eraginkortasuna murriztea eta emaitza faltsu-negatiboak ere ekar ditzake.
Inhibizioaz gain, azido nukleikoaren osotasuna galtzea gerta daiteke lagina prestatu aurretik bidalketa eta/edo biltegiratze baldintzen ondorioz. Bereziki, tenperatura altuek edo biltegiratze desegokiak zelulak eta azido nukleikoak kaltetu ditzakete. Zelulen eta ehunen finkapena eta parafinan txertatzea DNAren zatiketaren kausa ezagunak dira eta arazo iraunkorra da (ikus 1. eta 2. irudiak). Kasu hauetan, isolamendu eta purifikazio optimoak ere ez du lagunduko.

1. irudia | Inmobilizazioaren eragina DNAren osotasunean
Agarosa gel elektroforesiak erakutsi zuen autopsien parafina-sekzioetatik isolatutako DNAren kalitatea nabarmen aldatzen zela. Finkapen-metodoaren arabera, zatiki-luzera desberdinetako DNA zegoen erauzkinetan. DNA izoztutako lagin natiboetan eta formalina neutro tamponatuan finkatu zenean bakarrik kontserbatu zen. Bouin finkatzaile oso azidoa edo azido formikoa duen formalina tamponatu gabea erabiltzeak DNA galera nabarmena eragin zuen. Gainerako frakzioa oso zatikatuta dago.
Ezkerrean, zatien luzera kilobase bikoteetan adierazten da (kbp)

2. irudia | Azido nukleikoen jomugen osotasun galera
(a) Bi kateetan 3′-5′ tarte batek DNA helburuaren haustura eragingo du. DNAren sintesia zati txikian gertatuko da oraindik. Hala ere, primerren lotura-gune bat falta bada DNA zatian, anplifikazio lineala baino ez da gertatzen. Kasurik onenean, zatiek elkar berriro ase dezakete, baina etekinak txikiak izango dira eta detekzio-mailaren azpitik.
(b) Baseen galerak, batez ere despurinazioaren eta timidina dimeroaren eraketaren ondorioz, H-loturen kopuruaren eta Tm-ren jaitsiera dakar. Berotze-fase luzatuan, primerrak matrizearen DNAtik urtuko dira eta ez dira berotuko baldintza gutxiago zorrotzetan ere.
(c) Ondoko timina baseek TT dimero bat osatzen dute.
Beste arazo ohiko bat diagnostiko molekularrean, fenol-kloroformo erauzketekin alderatuta, azido nukleikoen askapen ez-optimoa da. Muturreko kasuetan, emaitza faltsu negatiboak gerta daitezke. Denbora asko aurreztu daiteke zelula-hondakinen lisi irakitearen edo digestio entzimatikoaren bidez, baina metodo honek askotan PCR sentikortasun baxua ematen du, azido nukleikoen askapen nahikoa ez delako.

Polimerasa jardueraren inhibizioa anplifikazioan zehar

Oro har, inhibizioa PCR emaitza ez-optimoetara eramaten duten faktore guztiak deskribatzeko kontzeptu edukitzaile gisa erabiltzen da. Zentzu biokimiko zorrotzean, inhibizioa entzimaren jarduerara mugatzen da, hau da, substratu-produktu bihurketa murrizten edo eragozten du DNA polimerasaren gune aktiboarekin edo bere kofaktorearekin (adibidez, Mg2+ Taq DNA polimerasarentzat) elkarreraginaren bidez.
Laginaren osagaiek edo erreaktiboak dituzten hainbat buffer eta erauzkinek zuzenean inhibi dezakete entzima edo haren kofaktoreak harrapatu (adibidez, EDTA), horrela polimerasa inaktibatuz eta, aldi berean, PCR emaitza txikiagoak edo faltsu negatiboak eraginez.
Hala ere, erreakzio-osagaien eta jomuga duten azido nukleikoen arteko elkarrekintza askori "PCR inhibitzaile" ere deitzen zaie. Zelularen osotasuna isolamenduaren bidez eten eta azido nukleikoa askatzen denean, laginaren eta inguruko disoluzioaren eta fase solidoaren arteko elkarrekintzak gerta daitezke. Adibidez, "harrapatzaileek" DNA kate bakarreko edo bikoitzekoari lotu diezaiokete elkarrekintza ez-kobalenteen bidez eta isolamenduan eta purifikazioan eragin dezakete, azkenean PCR erreakzio-ontzira iristen diren jomugen kopurua murriztuz.
Oro har, PCR inhibitzaileak gorputzeko fluido eta erreaktibo gehienetan daude, diagnostiko klinikoetarako erabiltzen direnak (gernuko urea, odoleko hemoglobina eta heparina), elikagai-osagarrietan (osagai organikoak, glukogenoa, gantzak, Ca2+ ioiak) eta ingurumeneko osagaietan (fenolak, metal astunak).

PCR inhibitzaile ohikoagoak bakterioetan eta zelula eukariotoetan, DNA ez-helburuan, ehun-matrizeen DNAri lotzen zaizkion makromolekuletan eta laborategiko ekipamenduan aurki daitezke, hala nola eskularruetan eta plastikoetan. Azido nukleikoak erauzketan zehar edo ondoren araztea da PCR inhibitzaileak kentzeko metodo hobetsia.
Gaur egun, erauzketa-ekipo automatizatu batzuek eskuzko protokolo asko ordezka ditzakete, baina inoiz ez da lortu helburuen % 100eko berreskurapena eta/edo purifikazioa. Baliteke inhibitzaile potentzialak oraindik ere azido nukleiko purifikatuetan egotea edo dagoeneko eragina izan izana. Estrategia desberdinak daude inhibitzaileen eragina murrizteko. Polimerasa egokia aukeratzeak eragin handia izan dezake inhibitzaileen jardueran. PCR inhibizioa murrizteko beste metodo frogatu batzuk polimerasaren kontzentrazioa handitzea edo BSA bezalako gehigarriak aplikatzea dira.
PCR erreakzioen inhibizioa barne-prozesuaren kalitate-kontrola (IPC) erabiliz frogatu daiteke.
Kontu handiz garbitu behar dira erauzketa-kitan dauden erreaktibo eta bestelako disoluzio guztiak, hala nola etanola, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanola eta fenola, azido nukleiko isolatutik. Haien kontzentrazioaren arabera, PCR aktibatu edo inhibi dezakete.